污水活性污泥处理过程中会产生大量的剩余污泥，数量可达到污水处理量的0.3%～0.5%(以含水率97%计)[1].剩余污泥除了具有含水率高、 易腐烂、 恶臭等特征外，还含有大量的病原菌、 寄生虫、 重金属和二 英、 苯并芘等难以降解的有毒、 有害、 致癌物质，极易对土壤、 地下水等造成二次污染[2].厌氧消化处理是对剩余污泥进行稳定化、 减量化和资源化过程中被广泛采用的处理手段，具有能耗低、 污泥稳定性好、 产生生物能源沼气等优点[3].影响剩余污泥厌氧消化过程的因子包括基础因素(厌氧污泥组成、 浓度、 污泥负荷等)和环境因素(pH、 ORP、 抑制性物质等)两大类，其中厌氧污泥的生物相组成和代谢活性对厌氧消化处理的过程进展发挥着重要的作用[4].在剩余污泥厌氧消化过程中，由于微生物构成、 对基质的适应性和接种量的不同，采用不同的接种厌氧污泥会对剩余污泥产CH4生成势形成不同程度的影响[5,6].深入探究剩余污泥厌氧消化过程中产CH4生成势与菌群动态变化的关系，一方面可对厌氧消化过程中剩余污泥的生化降解过程和产CH4潜能进行评价[7]，另一方面也能为剩余污泥厌氧消化工艺的关键操作参数优化提供依据[8,9]

　　剩余污泥厌氧消化的效率在很大程度上取决于厌氧微生物种群多样性及优势种群的活性[10,11].不同条件下厌氧消化运行的稳定性及效率与系统群落结构的变迁会存在一定的关联.厌氧污泥中主要存在水解发酵菌、 产氢产乙酸菌、 产甲烷菌及硫酸盐还原菌[12].其中产甲烷菌属于典型的古细菌，大致可以分为两类：一类主要利用乙酸产生甲烷，主要有产甲烷八叠球菌(Methanosarcina)和产甲烷髦毛菌(Methanothrix); 另一类利用氢和二氧化碳合成甲烷.由于传统微生物培养、 鉴定的局限性，近年来研究人员尝试应用基于16S rRNA的分子生物学技术(变性梯度凝胶电泳、 克隆文库技术、 荧光原位杂交)对厌氧污泥系统群落结构的变化进行分析.其中末端限制性片段多态性(terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)根据PCR扩增产物片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同来分析群落的结构及组成. Collins等[13]利用T-RFLP技术对接种污泥和接种后的污泥中微生物菌群变化进行研究后发现接种污泥中占优势的产甲烷菌群是Methanosarcinales、 Methanobacteria和Proteobacteria，而反应器运行稳定后占优势的菌群为Methanosarcina vacuolata和Methanobacterium palustre.T-RFLP技术可以很灵敏地检测微生物种类的微小变化，能够提供微生物种群结构和数量动态变化的信息，已成功应用于厌氧污泥产CH4菌的群落结构、 动态变化的检测等方面[14].

　　本研究采用剩余污泥厌氧消化产CH4生成势(biological methane potential，BMP)的测试方法[15, 16]，对两厂的剩余污泥厌氧消化进行了批次实验，在两厂剩余污泥的产的产CH4速率、 基质浓度回归的基础上得出产CH4的关键参数，评价不同剩余污泥在厌氧消化过程中的产CH4生成势; 同时对BMP实验前后的水质变化进行分析，结合厌氧消化前后T-RFLP的变化，对两种剩余污泥在厌氧消化过程中CH4生成势的差异进行解析[17].一方面可对不同剩余污泥厌氧消化过程中的产CH4潜能进行评价，同时也能为厌氧消化工艺中微生物菌群动态变化跟踪及关键参数优化提供依据.

　　1 材料与方法

　　1.1 厌氧污泥来源与特征

　　本研究所用的剩余污泥、 厌氧污泥分别来自于AP和DH污水处理厂，AP污水处理厂采用合流制明渠排水沟进水，进水水质易受降雨影响，且泥沙等无机颗粒含量较高; DH污水处理厂配套管网设施完善，进水为完整的下水管网收集的城市生活污水.污水厂长期的监测数据表明，AP厌氧污泥的VSS/TSS值多在0.5以下，而DH厌氧污泥的VSS/TSS值维持在0.6以上，厌氧消化池代谢活性较好.AP剩余污泥的VSS为8 050 mg ·L-1，TSS为14 350 mg ·L-1.DH剩余污泥的VSS为9 250 mg ·L-1，TSS为13 230 mg ·L-1. 1.2 BMP实验设计

　　AP-BMP、 DH-BMP共设置6组不同的污泥负荷F/M(0、 0.1、 0.25、 0.4、 0.6、 1)进行实验，由于污泥浓缩的不均衡性，实测F/M如表1所示.BMP实验在120 mL的血清瓶中进行，依据测试基质浓度加入定量剩余污泥.采用Owen等[15]提出的厌氧微量元素溶液配方，其中CaCl2 ·2H2 O、 NH4Cl、 MgCl2 ·6H2 O、 KCl、 MnCl2 ·4H2 O、 CoCl2 ·6H2 O、 H3BO3、 CuCl2 ·2H2 O、 Na2MoO4 ·2H2 O、 ZnCl2的浓度分别为16.7、 26.6、 120、 86.7、 1.33、 2、 0.38、 0.18、 0.17、 0.14 g ·L-1.每个血清瓶加入27 mL的微量元素液体和5.4 mL的(NH4)2HPO4(26.7 g ·L-1)，之后依据不同的F/M比值接种厌氧污泥、 剩余污泥后，盖上胶盖并用铝箔封口.在35℃下旋转培养箱内进行实验，实验过程中以玻璃注射筒(50 mL)测量总产气量，并利用GC-ECD测定CH4、 CO2和H2的比例.共设置两组平行实验，取均值进行产气量、 水质分析. AP-BMP、 DH-BMP分别设置两组平行实验，产气量测量可精确到0.1 mL.

　　表 1 BMP实验实测F/M比

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 常规指标

　　常规水质指标，包括pH(Suntex Ion Analyzer 3000A)、 TSS(Sartorius Analytic oven)、 NH+4-N(Autotitrator AT-400KYOTO)、 TKN(Autotitrator AT-400KYOTO)、 COD(回流加热滴定)等，均依照美国EPA规定的Standard Methods[18]规定进行.实验过程中气体成分(CH4、 CO2和H2)的测量采用气相色谱(China Chromatography GC8900T)进行.

　　1.3.2 T-RFLP分析

　　图1 实测CH4累积产气量与回归曲线

　　本研究参照了Lueders等[19]建立的T-RFLP方法对实验前后厌氧污泥的生物多样性进行分析，实验步骤如下：①通过PCR来复制DNA样品中的目标基因，引物为在5′的尾端上带有荧光的Ar 109f和Ar 912r*，首先在94℃预变性5 min，扩增循环阶段包括94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共循环28 cycles，最后在72℃条件下延伸6 min.②在8.5 μL的PCR产物中加入0.5 μL TaqⅠ和1.5 μL的缓冲溶液，在65℃条件下消化切割2 h; ③将切割后的片段利用电泳分离并以荧光侦测器(全自动遗传分析仪，ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)检测片段上所带的荧光强度. Lueders等[19]成功分离、 克隆出产CH4髦毛菌Methanosaeta spp.、 产CH4微菌Methanomicrobiaceae、 RC-I和产CH4杆菌Methanobacteriaceae，未能定性的菌种归入Diverse类.

　　1.3.3 数据分析

　　剩余污泥厌氧消化过过程中累积CH4产气量采用改进的Gompertz模型回归分析[20]

　　式中，y为累积产气量(mL); δ为产气末期校正斜率(mL·h-1); t为反应时间(h); A为平衡产气量(mL); Rmax：最大产气速率(mL ·h-1); λ：迟滞期(h). 底物的厌氧代谢过程实质上是一系列的酶促反应，因此采用Michaelis-Menten模型描述剩余污泥浓度与比产气速率的关系： V=Vmax · S Km+S (2) 式中，Vmax为最大比产气速率[mL ·(g ·d)-1]; V为比产气速率[mL ·(g ·d)-1]; Km为半饱和常数(mg ·L-1); S为基质浓度(mg ·L-1).

　　2 结果与讨论

　　2.1 BMP产气结果分析

　　AP-BMP、 DH-BMP批次实验持续时间分别为439 h、 765 h，6组不同的投配比设计累积产气量存在着明显的差异.实验初期累积产气量差异不明显(图1)，后期逐步增大.两组实验气体成分均以CH4(80%)、 CO2(20%)为主，同时存在少量的H2(不足1%).实验产气均匀，可分为两个阶段.第一阶段产气速率大，产甲烷菌利用溶解性COD或易水解性物质进行厌氧发酵; 之后产气速率逐渐降低至稳定水平，该阶段的限速步骤为剩余污泥的水解过程，产气随着水解的进程而稳定增加.至该实验结束时，每天仍有稳定体积的气体产生，表明微生物的水解、 厌氧产CH4仍在进行中.应用改进的Gompertz模型对AP-BMP、 DH-BMP产气进行回归后的参数如表2所示.两厂的厌氧污泥产气数据与改进的Gompertz模型拟合较好(R2>0.99).通常厌氧消化过程中的限速步骤为水解破壁过程[21, 22]，在无添加外来基质的0号样品中，AP、 DH厌氧污泥的迟滞期分别为20.00 h、 12.93 h，表明DH厌氧污泥的活性较高.

　　表2 改进Gompertz模型回归BMP实验参数

　　图2 Michaelis-Menten模型回归BMP产CH4速率参数

　　采样Michaelis-Menten模型对两个批次实验的基质浓度、 比产气速率回归后的结果如图2所示(R2>0.99).AP、 DH厌氧污泥的最大比产气速率差距不大，分别为74.21、 51.99 mL ·(g ·d)-1，但两厂厌氧污泥的Km存在着显著的差异，DH厌氧污泥的Km为19 005 mg ·L-1而AP厌氧污泥的Km高达54 098 mg ·L-1.Km是表征底物亲和力的常数，表明AP厌氧污泥对该厂剩余污泥的适应性差，需要在较高的基质浓度下才能表现出较好的产CH4性能.

　　2.2 水质变化分析

　　AP-BMP、 DH-BMP两个批次实验结束时不同F/M条件下的水质状况如下表3所示.两个批次实验中随着F/M增大，pH由弱酸性渐变为弱碱性，分别位于在6.8~7.2、 6.7~7.1范围内.0号呈弱酸性，可能由未添加基质，厌氧污泥自身的水解造成[23].DH-BMP与AP-BMP实验结束时ORP值分别位于-235~-280 mV与-235~-282 mV范围内.随着F/M比的增大，两个批次实验的ORP值都呈下降的趋势.厌氧环境的主要标志是发酵液具有低的ORP，不同的厌氧消化体系和不同的厌氧微生物对ORP的要求不同[24].

　　两批次实验中在高F/M条件下下CODT下降明显.与AP-BMP实验相比，DH-BMP实验结束后CODT下降更为显著，5号样品中由之前的47 000 mg ·L-1下降至32 480 mg ·L-1，在高F/M条件下厌氧消化进行得更为完全.批次实验前后，NH+4-N浓度均有提高，不同F/M条件下NH+4-N变化差异较大，DH-BMP实验中5号样品实验结束后NH+4-N浓度达到了755.5 mg ·L-1.污泥厌氧消化过程中，污泥的水解是限速步骤.在高F/M条件下，厌氧污泥代谢旺盛，使得剩余污泥的破壁、 氨化过程进行得较为完全，从而使得NH+4-N显著提升[4].两个批次实验前后TSS变化呈现出与CODT类似的趋势，高F/M条件下下降趋势明显，DH-BMP实验中5号样品的TSS由实验前的45 100 mg ·L-1下降至38 050 mg ·L-1.综合比较AP-BMP与DH-BMP实验前后水质变化，DH-BMP实验前后CODT、 TSS下降趋势更加明显，表明DH-BMP过程中代谢活跃，厌氧消化过程进行得较为完全.

表3 BMP实验末期不同F/M条件下主要水质

　　图3 AP、 DH剩余污泥厌氧消化前后主要T-RFs丰度变化

　　2.3 厌氧污泥生物多样性分析

　　图3表示了以AP-BMP、 DH-BMP实验前后产甲烷功能菌组成的变化情况.与AP-BMP、 DH-BMP两个批次实验中产CH4、 水质变化情况相一致，DH接种厌氧污泥中产甲烷菌群的相对含量高于AP接种厌氧污泥，AP-BMP中0号样品的杂菌(Diverse)相对含量超过60%.DH厌氧污泥中产甲烷功能菌群丰富且相对含量较高，可能是DH-BMP实验中半饱和常数Km显著低于AP-BMP中回归数值的重要原因.

　　AP-BMP实验后，未添加基质的0号实验结束后杂菌(Diverse)相对含量降至14%，这可能是由于基质的缺乏，产甲烷菌将杂菌(Diverse)分解代谢造成.4号样品中的杂菌(Diverse)含量也有所降低但幅度不大.同时实验结束后，两组的产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)、 产甲烷微菌Methanomicrobiaceae(80 bps)和RC-I(389 bps)的相对含量皆有提高.DH-BMP实验前后产甲烷功能菌的组成变化情况与AP-BMP变化类似.DH-BMP实验结束时杂菌(Diverse)含量降低，0号、 5号样品中杂菌(Diverse)相对含量不足17%.产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)、 产甲烷微菌Methanomicrobiaceae (80 bps)和RC-I(389 bps)的相对含量皆有所提高，表明产甲烷菌的活性和相对丰度在实验过程中得以提高.已有研究发现产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.主要以乙酸为基质生成甲烷[25]，实验结束后产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.相对含量提高，而其它两种产甲烷菌以H2和CO2为基质生成甲烷，由于两组BMP实验中H2的生成量较低(不足1%)，因此产甲烷杆菌Methanobacteriacea (88 bps)、 产甲烷微菌Methanomicrobiaceae(80 bps)相对含量变化不如产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)增加显著[4].

　　3 结论

　　(1)AP、 DH剩余污泥厌氧消化产CH4采用改进Gompertz模型回归的最大比产气速率数值接近，分别达到了74.21 mL ·(g ·d)-1、 51.99 mL ·(g ·d)-1，但对基质剩余污泥的半饱和常数Km差异较大，分别为54 098 mg ·L-1和19 005 mg ·L-1，表明AP剩余污泥亲和性差、 难于厌氧消化.

　　(2)BMP实验结束后，TSS、 CODT有所下降，NH+4-N显著提高，且高污泥负荷F/M条件下水质变化趋势更为显著.与AP-BMP实验相比，DH-BMP水质变化显著.

　　(3)两批次实验前后T-RFLP分析结果与其生化产CH4势相一致，实验结束后杂菌(Diverse)相对含量显著下降，产甲烷髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)、 产甲烷微菌 Methanomicrobiaceae(80 bps)和RC-I(389 bps)的相对含量皆有所提高，且DH-BMP样品中产甲烷功能菌群相对含量提升程度高于AP-BMP.